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鸡心乳酸脱氢酶(L-LDH)

基本信息
所属分类:
酶及辅酶
英文名称
L-Lactate dehydrogenase
缩写
L-LDH
货号
AA0094B
规格
规格可定制
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产品描述

 

一、产品介绍

      观:

白色无定形粉末。

冻干缓冲液:

50mM PB-K1mg/ml BSApH7.0

比  活  力:

≥70U/mg干粉(乳酸底物法);≥100U/mg干粉(丙酮酸底物法)。

稳  定  性:

干粉于-20至少稳定一年。

分  子  量:

~38kD (SDS-PAGE)

等  电  点:

7.89

pH稳定性 :

4.010.0稳定 (500-1000U/L2524hr)              Figure 1      

最  适pH

10.0-11.0 (乳酸底物法, Figure 4)7.0~8.0 (丙酮酸底物法, Figure 5)                         

最适温度 

60                                         Figure 2 and 6

热稳定性 

1kU/L60加热30min不失活(乳酸底物法)。        Figure 3

稳  定  剂:

添加≥1mg/ml BSA有助于稀释样品的稳定。

      溶:

用去离子水或50mM PB-K (pH 7.0) 复溶。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

二、乳酸底物法测定酶活

2.1 测定原理

在强碱性条件下,鸡心L-LDH催化L-乳酸与NAD+反应生成丙酮酸和NADH。在一定范围内NADH的生成速率与L-LDH活力成正比。在340nm处测定NADH的生成速率,根据酶活计算公式即可测出酶活力。1个酶活单位(U)等于在下述反应条件下每分钟生成1微摩尔NADH所需的酶量。

2.2   检测方法

1.     酶稀释液:50mM PB-K1mg/ml BSA0.1% NaN3pH7.0。过0.22um滤膜后2-8保存,保质期1年。

2.     Buffer350mM CAPSMr=221.32),0.1% NaN3pH10.0 (25),过0.22um滤膜后2-8保存,保质期一个月。

3.     R11M 乳酸锂,0.1% NaN3。过0.22um滤膜后2-8保存,保质期一个月。

4.     R29mM NAD 0.1% NaN3。过0.22um滤膜后2-8保存,保质期为一周。

1.     R临用前按Buffer : R1 : R2=920ul : 80ul : 200ul比例混合,2-8保存,保质期1天。用前恢复室温。

2.     待测酶液S称量所需的酶粉,用去离子水或50mM PB-K (pH 7.0)复溶,定容到既定体积配制成待测酶液S。用酶稀释液将其稀释至200-2000U/L内的2-5个梯度。

3.     酶活检测步骤

 

1)   1200ulR添加至“d=1.0cm”的石英比色皿中,37℃温育1min;然后加入20ul待测酶液 S,充分混匀后,37℃反应至3min;记录第2-3minOD340的变化,并计算每分钟吸光值变化率(△As/min)。测活历程如下:

 

2)   重复以上步骤,用20μl酶稀释液作为阴性对照。记录空白吸光值(△Ab/min)。

1.     计算公式


 

 

Vt

:反应液总体积(ml

ε

NADH摩尔吸光系数6.22cm2/micromole

Vs

:样品体积(ml

d

:比色杯光程(1cm

D

:稀释倍数

A/min

△As/min-△Ab/min

方向

:升反应

线性

0-2000U/L,建议稀释至200-2000U/L

2.3 酶性质附图(乳酸底物法)

 

三、丙酮酸底物法测定酶活                

3.1  测定原理

 

在中性偏碱条件下,鸡心L-LDH催化丙酮酸和NADH反应生成L-乳酸与NAD+。在一定范围内NADH的消耗速率与L-LDH活力成正比。在340nm处测定NADH的消耗速率,根据酶活计算公式即可测出酶活力。1个酶活单位(U)等于在下述反应条件下每分钟消耗1微摩尔 NADH所需的酶量。

3.1  检测方法

1.     Buffer100mM PB-KpH7.0

2.     酶稀释液:50mM PB-K1mg/ml BSA0.1%NaN3pH7.0。过0.22um滤膜后2-8保存,保质期1年。

3.     R1100mM PB-K25.4mM丙酮酸钠盐或钾盐,0.1%NaN3pH7.0。过0.22um滤膜后2-8保存,保质期一个月。

4.     R210mM Tris-HCl 10mg/ml NADH0.1%NaN3pH9.7,过0.22um滤膜后2-8保存,保质期1周。

5.     R临用前按Buffer : R1 : R2=3000ul : 100ul : 50ul比例混合,2-8保存,保质期1天。用前恢复室温当OD340<0.8时,重新配置R。若OD340依然小于0.8,请重新配置R2

6.     待测酶液S称量所需的酶粉,用去离子水或50mM PB-K (pH 7.0)复溶,定容到既定体积配制成待测酶液S。用酶稀释液将其稀释至500-3000U/L范围内的2-5个梯度。

7.     酶活检测步骤

 

1)   1200ulR添加至“d=1.0cm”的石英比色皿中,37℃温育1min;然后加入20ul待测酶液 S,充分混匀后,37℃反应至3min;记录第2-3minOD340的变化,并计算每分钟吸光值变化率(△As/min)。测活历程如下:

 

2)   重复以上步骤,用20μl酶稀释液作为阴性对照。记录空白吸光值(△Ab/min)。

 

8.     计算公式

        

 

Vt

:反应液总体积(ml

ε

NADH摩尔吸光系数6.22cm2/micromole

Vs

:样品体积(ml

d

:比色杯光程(1cm

D

:稀释倍数

A/min

△As/min-△Ab/min

方向

:降反应

线性

0-3000U/L,建议稀释至500-3000U/L

3.3 酶性质附图(丙酮酸底物法)

上一条
DNA酶I
下一条
亮氨酸氨基肽酶